貼壁細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存及注意事項(xiàng)
一、接收注意事項(xiàng):
貼壁細(xì)胞經(jīng)過快遞運(yùn)輸顛簸會(huì)出現(xiàn)漂浮脫落等情況， 收到先放培養(yǎng)箱靜置穩(wěn)定。如有脫落需收集處理，處理細(xì)節(jié)請(qǐng)查閱以下文件，原瓶?jī)?nèi)為運(yùn)輸培養(yǎng)液，血清含量只有5%，需及時(shí)更換專用完全培養(yǎng)基。
二、傳代步驟：
準(zhǔn)備工作：胰酶和完全培養(yǎng)基（需要提前37度復(fù)溫）、PBS（常溫）避免細(xì)胞遇冷受刺激
（1） 吸出原培養(yǎng)液
（2） 加入2ml左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤(rùn)洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄
（3） 加入1ml左右0.25%含EDTA的胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之浸潤(rùn)所有細(xì)胞。
（4） 根據(jù)不同的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱時(shí)及時(shí)關(guān)注消化時(shí)間，消化約2-3min，顯微鏡下看到細(xì)胞中間的細(xì)胞明顯分離變圓細(xì)胞間隙變大，顯微鏡下看細(xì)胞呈單個(gè)游離狀態(tài)，側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時(shí)可終止消化，可以輕拍培養(yǎng)瓶側(cè)身。（消化時(shí)主要看消化狀態(tài)，如果沒有變圓，側(cè)立時(shí)不能滑落時(shí)，可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，每30s觀察一次細(xì)胞）
（5） 加入3ml含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫壁并在液體里反復(fù)輕輕吹打（不要太用力）使細(xì)胞盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液。
（6） 收集細(xì)胞懸液離心，1000rpm/min（約250g） 5分鐘，離心完吸出上清丟棄。
（7） 加入新鮮完全培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細(xì)胞即可，按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足完全培養(yǎng)基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)。
（8） 檢查培養(yǎng)箱二氧化碳，溫度和水盤。
三、后續(xù)處理建議：
傳代后2-3天換液一次即可，（如細(xì)胞第二天全部貼壁培養(yǎng)基顏色變黃，可以換液，）無需每天換液（換液太勤可能會(huì)損失細(xì)胞影響細(xì)胞狀態(tài)）換液時(shí)候如果沒有特殊情況也可以不用PBS清洗。
四、貼壁細(xì)胞凍存：
1）鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)到80-90%即可凍存，一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml;
2）前半部分和傳代方式一樣，細(xì)胞消化離心后去掉上清。用1ml配制好的凍存液重懸細(xì)胞
3）將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息
4）如使用的是無血清凍存液可直接放-80℃冰箱過夜后續(xù)可轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存。
如使用的是程序凍存液，需要梯度降溫法進(jìn)行處理。
