HAKATA NK擴增試劑盒(含培養基)說明書
規格：2L體系
貨號：HNK-CELLS plus
品牌：HAKATA
廠家：上海慧穎生物科技有限公司
【溫馨提示】
為了能獲得穩定可靠的結果，請嚴格按照以下所述步驟進行操作，并使用我們推薦的實驗耗材及試劑。本試劑盒包含四種刺激組分(NK Cell Grower1~4)，每管體積為1ml，建議每管組分拿出靜置后再加入到培養基中，并用培養基潤洗管子，以確保每管所有組分都能加入到培養基中。請認真閱讀說明書配置每種擴增液！
【實驗材料】
NK Cell Culture Medium(1000 ml) X 2
NK Cell Grower 1(1 ml) NK Cell Grower 2(1 ml)
NK Cell Grower 3(1 ml) NK Cell Grower 4(1 ml)
懸浮細胞專用細胞培養瓶(T75、T175)(透氣蓋培養瓶，推薦康寧品牌)
懸浮細胞專用培養袋
淋巴細胞分離液
無菌生理鹽水或PBS
【實驗操作方案】
* 所有的工作必須在無菌室中進行，請嚴格遵守無菌操作規范，使用無菌耗材。
1、培養瓶包被
(1) 在T-75 cm2 懸浮培養瓶中，加入8 ml PBS 和1ml NK Cell Grower 1；
(2) 輕輕搖晃，使溶液在培養瓶瓶底擴散，鋪滿瓶底；
(3) 37℃培養箱靜置2 h 或在4℃靜置過夜；
(4) 移除包被溶液，用15 ml PBS 潤洗瓶底1 次(請勿吹打瓶底)，洗過的培養瓶要立即使用。
2、血液分離
(1) 采集40 ml外周血于抗凝管(務必用肝素抗凝管)，800g，15 min室溫離心；
(2) 自體血漿制備：取上清血漿，置于水浴鍋中56℃，滅活30 min后 1100g，15 min室溫離心，用移液管將上清轉移至新的15ml管內，4℃保存備用；
（3）取上述離心后下部細胞成分，加PBS至40 ml，混勻，加到2個裝有2ml醫療級人淋巴細胞分離液的5ml離心管中，室溫下， 500g 離心30 min，慢升慢降(加速度2，減速度0)；
（4）離心后，血液被分為4 層，由血漿(上層)、血漿和分離液之間的單個核細胞(第
2 層)、分離液(第3 層)和紅細胞層(底層)構成。
3、制備PBMC
（1）用吸管將第2 層單個核細胞收集至新的離心管；
（2）加入40 ml PBS洗滌細胞懸液，300g 離心8 min；
（3）棄去上清液，再加入40 ml PBS洗滌細胞懸液，300g 離心8 min。
（4）棄去上清液，加入20 ml NK Cell Culture Medium稀釋細胞懸液，混勻，取100 μl 懸液細胞計數，余下懸液300g 離心 8 min。
注：整套試劑可激活4-6*107PBMC，多余細胞可以棄去。
4、NK 細胞擴增
(1) Day0，配置NK細胞擴增液A：將全部的NK Cell Grower 2加入到25 ml NK Cell Culture Medium 中，同時加入2.5 ml滅活后的自體血漿。用該擴增液重懸將上述細胞到2~2.5*106/ml(根據收獲的PBMC細胞數來決定重懸密度, 確保重懸密度在該范圍內, 有利于NK細胞激活)；
（2）在已包被的T75培養瓶中，加入以上細胞懸浮液(以20~25ml最合適)，請沿培養瓶側壁加入細胞，動作需輕柔，請勿直接吹打培養瓶底；
(3）5% CO2、37℃培養3天(在此期間請勿移動細胞，整個培養以靜置為主)；
(4) Day3，配置NK細胞擴增液B：將全部的NK Cell Grower 3加入到460 ml NK Cell Culture Medium 中。用移液管輕輕吹打T75培養瓶中的細胞，將細胞懸液全部轉入T175培養瓶內，加入40 ml NK細胞擴增液B(剩余擴增液B放2-8℃保存)，同時補加4 ml滅活后的自體血漿；
(5) Day5，用移液管輕輕吹打細胞，取細胞進行計數，加入約80 ml NK細胞擴增液B于T175培養瓶內，同時補加4 ml滅活后的自體血漿，使細胞密度保持在1*106/ml左右；
(6) Day7，用移液管輕輕吹打細胞，將細胞懸液平均轉入兩個培養袋內，加入剩余的NK細胞擴增液B和剩余的滅活自體血漿（每個培養袋等量加入）；
(7) Day9，配置NK細胞擴增液C：將全部的NK Cell Grower 4加入到剩余的1500 ml NK Cell Culture Medium 中。視細胞生長密度，每個培養袋補加350-450 ml NK細胞擴增液C（使補液后細胞密度保持在0.8*106/ml左右）(剩余擴增液C放2-8℃保存)；
(8) Day11，向每個培養袋內補加等量剩余的NK細胞擴增液C；
(9) Day14，鑒定細胞，同時取樣檢測真菌、細菌、支原體、內毒素等指標。
所有培養液使用前需先預溫，用多少預溫多少, 避免反復預溫對細胞因子活性的影響！
5、細胞收集
（1）經過14 天的培養，將細胞懸浮液從培養袋，轉入大型的離心瓶，用離心機以600g 離心10 min，分離細胞和培養基；
（2）小心地移去上清液，用含有0.1%人類血清白蛋白的生理鹽水(0.1%HSA 生理鹽
水)，懸浮所有的細胞沉淀物，收集到一個離心瓶中。重復離心，清洗細胞3 次；
（3）收集細胞，用適量含有1%人類血清白蛋白的生理鹽水重懸細胞，通過一次性
細胞篩(200目)過濾，收集并注入含有1%人類血清白蛋白的生理鹽水回輸液中，總量為100~200 ml。封裝好后送病房，同時留樣封存以備日后檢測。
附錄 操作流程表：
每天補液操作流程 | ||||
天數 | 培養瓶或袋 | 數量 | 加入培養基（ml） | 加入自體血漿（ml） |
day0 | T75 | 1 | 擴增液A 25 | 2.5 |
day3 | T175 | 1 | 擴增液B 40 | 4 |
day5 | T175 | 1 | 擴增液B 80 | 4 |
day7 | 培養袋 | 2 | 擴增液B 170/袋 | 剩余平均全部加入 |
day9 | 培養袋 | 2 | 擴增液C 350-450/袋 | 一 |
day11 | 培養袋 | 2 | 剩余擴增液C平均加入 | 一 |
