NK 細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作方案
(1L 體系版本)
為了能獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果，請嚴(yán)格按照以下所述步驟進(jìn)行操作，并使用我們推薦的實驗耗材及試劑。本試劑盒包含四種刺激組分(NK Cell Grower1~4)，每管體積為500 μl，建議每管組分拿出靜置后再加入到培養(yǎng)基中，并用培養(yǎng)基潤洗管子，以確保每管所有組分都能加入到培養(yǎng)基中。請認(rèn)真閱讀說明書配置每種擴(kuò)增液！
【實驗材料】
NK Cell Culture Medium(1000 ml)
NK Cell Grower 1(500 μl) NK Cell Grower 2(500 μl) NK Cell Grower 3(500 μl) NK Cell Grower 4(500 μl)
懸浮細(xì)胞專用細(xì)胞培養(yǎng)瓶(T25、T75、T175)(透氣蓋培養(yǎng)瓶，推薦康寧品牌) 懸浮細(xì)胞專用培養(yǎng)袋
淋巴細(xì)胞分離液
無菌生理鹽水或PBS
【實驗操作方案】
* 所有的工作必須在無菌室中進(jìn)行，請嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，使用無菌耗材。
1、培養(yǎng)瓶包被
(1) 在T-25 cm2 懸浮培養(yǎng)瓶中，加入3.5 ml PBS 和500 μl NK Cell Grower 1；
(2) 輕輕搖晃，使溶液在培養(yǎng)瓶瓶底擴(kuò)散，鋪滿瓶底；
(3) 37℃培養(yǎng)箱靜置2 h 或在4℃靜置過夜；
(4) 移除包被溶液，用 5 ml PBS 潤洗瓶底 1 次(請勿吹打瓶底)，洗過的培養(yǎng)瓶要立即使用。
2、血液分離
（1） 采集 20 ml 外周血于抗凝管(務(wù)必用肝素抗凝管)，800g，15 min 室溫離心；
（2） 自體血漿制備：取上清血漿，置于水浴鍋中 56℃，滅活 30 min 后 1100g，15 min 室溫離心，用移液管將上清轉(zhuǎn)移至新的 15 ml 管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆茫?/span>
（3） 取上述離心后下部細(xì)胞成分，加 PBS 至 20 ml，混勻，加到 2 個裝有 10 ml 醫(yī)療級人淋巴細(xì)胞分離液的 50 ml 離心管中，室溫下， 500g 離心 30 min，慢升慢降(加速度 2，減速度 0)；
（4） 離心后，血液被分為 4 層，由血漿(上層)、血漿和分離液之間的單個核細(xì)胞(第 2
層)、分離液(第 3 層)和紅細(xì)胞層(底層)構(gòu)成。
3、制備PBMC
（1） 用吸管將第 2 層單個核細(xì)胞收集至新的離心管；
（2） 加入 40 ml PBS 洗滌細(xì)胞懸液，300g 離心 8 min；
（3） 棄去上清液，再加入 40 ml PBS 洗滌細(xì)胞懸液，300g 離心 8 min。
（4） 棄去上清液，加入 20 ml NK Cell Culture Medium 稀釋細(xì)胞懸液，混勻，取 100 μl 懸液細(xì)胞計數(shù)，余下懸液 300g 離心 8 min。
注：整套試劑可激活2-2.5*107PBMC，多余細(xì)胞可以棄去。
4、NK 細(xì)胞擴(kuò)增
(1) Day0，配置NK細(xì)胞擴(kuò)增液A：將全部的NK Cell Grower 2(500 μl)加入到10 ml NK Cell Culture Medium 中，加入1 ml滅活后的自體血漿。用該擴(kuò)增液重懸將上述細(xì)胞到2~2.5*106/ml(該套試劑盒中只能配置10 ml擴(kuò)增液A，即重懸2~2.5*107 細(xì)胞，因此多余細(xì)胞在上述計數(shù)后可以棄去)；
（2） 在已包被的T25培養(yǎng)瓶中，加入以上細(xì)胞懸浮液(以8 ml最合適，即起始細(xì)胞總數(shù)為1.6~2*107)，請沿培養(yǎng)瓶側(cè)壁加入細(xì)胞，動作需輕柔，請勿直接吹打培養(yǎng)瓶底；
(3）5% CO2、37℃培養(yǎng)3 天(在此期間請勿移動細(xì)胞，整個培養(yǎng)以靜置為主)；
(4) Day3，配置NK細(xì)胞擴(kuò)增液B：將全部的NK Cell Grower 3(500 μl)加入到130 ml NK Cell Culture Medium 中。用移液管輕輕吹打T25培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入15 ml NK細(xì)胞擴(kuò)增液B(剩余擴(kuò)增液B放2-8℃保存)， 同時補(bǔ)加1.5 ml滅活后的自體血漿；
(5) Day5，用移液管輕輕吹打細(xì)胞，取細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，加入約30 ml NK細(xì)胞擴(kuò)增液B于T75培養(yǎng)瓶內(nèi)，同時補(bǔ)加1.5 ml滅活后的自體血漿，使細(xì)胞密度保持在1*106/ml左右；
(6) Day7，用移液管輕輕吹打細(xì)胞，將細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)入T175培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入剩余的
NK細(xì)胞擴(kuò)增液B和剩余的滅活自體血漿；
(7) Day9，配置NK細(xì)胞擴(kuò)增液C：將全部的NK Cell Grower 4(500 μl)加入到800 ml NK Cell Culture Medium 中。用移液管輕輕吹打細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)袋內(nèi)， 視細(xì)胞生長狀態(tài)，補(bǔ)加200~250 ml NK細(xì)胞擴(kuò)增液C(剩余擴(kuò)增液C放2-8℃保存)；
(8) Day11，向培養(yǎng)袋內(nèi)補(bǔ)加剩余的NK細(xì)胞擴(kuò)增液C；
(9) Day14，鑒定細(xì)胞，同時取樣檢測真菌、細(xì)菌、支原體、內(nèi)毒素等指標(biāo)。
注：所有培養(yǎng)液使用前需先預(yù)溫，避免低溫對NK細(xì)胞活化的影響！
5、細(xì)胞收集
（1） 經(jīng)過14 天的培養(yǎng)，將細(xì)胞懸浮液從培養(yǎng)袋，轉(zhuǎn)入大型的離心瓶，用離心機(jī)以600g 離心10 min，分離細(xì)胞和培養(yǎng)基；
（2） 小心地移去上清液，用含有0.1%人類血清白蛋白的生理鹽水(0.1%HSA 生理鹽水) 懸浮所有的細(xì)胞沉淀物，收集到一個離心瓶中。重復(fù)離心，清洗細(xì)胞3 次；
（3） 收集細(xì)胞，用適量含有1%人類血清白蛋白的生理鹽水重懸細(xì)胞，通過一次性細(xì)胞篩(200目)過濾，收集并注入含有1%人類血清白蛋白的生理鹽水回輸液中，總量為100~200 ml。封裝好后送病房，同時留樣封存以備日后檢測。
